|
Uncoupling of DNA restriction and DNA translocation functions of the Type I restriction modification enzyme EcoR124I
Šišáková, Eva ; Weiserová, Marie (vedoucí práce) ; Janeček, Jiří (oponent) ; Janščák, Pavel (oponent)
4 Lívery l. Miestne cielenou mutagerÉzousme pripravili kolekciu Ínutantovsjednou substitrlciou konzervovanýchaminokyselinových zvyškov v motívochII a III v N.ÍerminálnejónÉne podjednotkyHsdRenzymuEcoRl24I:Dl5lA, El65A, El65D, EI65IIadK167A. r Pozitívnym a negativnym komplementďným tostonrilr ylvo sme zistili' Že všet$ mutantyprejavili fenoýp ťď. r Test restrikcie DNA ',?vjrro potvrdil výsledky in vivo testov,Že Žiadnyz mutantov nebolschopníštiepiťplazmidovúDNA nalineá'muforrnu. r TestviizbovostiDNA (EMSA) neodhalilžiadnevýznamrÉrozďely medzidivolcým a mutantnýmienzýmamiv schopnostiviazaťDNA. r Metóda na meranieATPázovej aktivity,zaloŽeruínapoužitíproteínuviaŽúcehgfosfáL ukázalu Že substituciev motíveII a Itr u váčšinymutantovspÓsobila virc než2. nrásobnúredukciu hydrolýzy ATP. Mutant Kl67A bol jeďný' ktoý prejavil aktivifu porovnatelhús divolcýmenzýmom. r Translokačnýprocesbol analyzovanýdisociácioutriplexu na stopped.fbw fluorimetri a pornocoumagnetickejpinzeý. obe techniky ukázali zntženétranslokďnérýchloati mutantov,rozdiely medzi mutantamia divohým enzýmom boli ešteýraznejšie pri merani na magrretickej pinzete. Pozorovali sme takztiez zmenerrú procesivih1iniciáciua bimoďílnudistribúciuRl ýchlostí. 2. Aminokyselinovézvyšlry Q a Y v motíveQxxxY podjednotkyHsdR boli substituované...
|
|
Uncoupling of DNA restriction and DNA translocation functions of the Type I restriction modification enzyme EcoR124I
Šišáková, Eva ; Weiserová, Marie (vedoucí práce) ; Janeček, Jiří (oponent) ; Janščák, Pavel (oponent)
4 Lívery l. Miestne cielenou mutagerÉzousme pripravili kolekciu Ínutantovsjednou substitrlciou konzervovanýchaminokyselinových zvyškov v motívochII a III v N.ÍerminálnejónÉne podjednotkyHsdRenzymuEcoRl24I:Dl5lA, El65A, El65D, EI65IIadK167A. r Pozitívnym a negativnym komplementďným tostonrilr ylvo sme zistili' Že všet$ mutantyprejavili fenoýp ťď. r Test restrikcie DNA ',?vjrro potvrdil výsledky in vivo testov,Že Žiadnyz mutantov nebolschopníštiepiťplazmidovúDNA nalineá'muforrnu. r TestviizbovostiDNA (EMSA) neodhalilžiadnevýznamrÉrozďely medzidivolcým a mutantnýmienzýmamiv schopnostiviazaťDNA. r Metóda na meranieATPázovej aktivity,zaloŽeruínapoužitíproteínuviaŽúcehgfosfáL ukázalu Že substituciev motíveII a Itr u váčšinymutantovspÓsobila virc než2. nrásobnúredukciu hydrolýzy ATP. Mutant Kl67A bol jeďný' ktoý prejavil aktivifu porovnatelhús divolcýmenzýmom. r Translokačnýprocesbol analyzovanýdisociácioutriplexu na stopped.fbw fluorimetri a pornocoumagnetickejpinzeý. obe techniky ukázali zntženétranslokďnérýchloati mutantov,rozdiely medzi mutantamia divohým enzýmom boli ešteýraznejšie pri merani na magrretickej pinzete. Pozorovali sme takztiez zmenerrú procesivih1iniciáciua bimoďílnudistribúciuRl ýchlostí. 2. Aminokyselinovézvyšlry Q a Y v motíveQxxxY podjednotkyHsdR boli substituované...
|
| |
| |
| |