|
|
Vývoj a implementace nových přístupů umožňujících proteomickou charakterizaci kostních tkání ve stomatochirurgii
Michalus, Iva ; Hynek, Radovan (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
1 Abstrakt Proteomika je bouřlivě se rozvíjející obor, který nachází uplatnění v mnoha oblastech medicíny, včetně stomatologie. Přesto proteomická charakterizace kostních tkání ve stomatochirurgii není stále běžně využívána. Hlavní příčinou je značná komplikovanost používaných analytických přístupů, která vyplývá z nerozpustného charakteru kostních tkání. Cílem této práce bylo vyvinout a aplikovat přímočarou metodiku, která by mohla vést k rutinnímu využití proteomiky i v této oblasti. Nejprve byla s využitím prasečích čelistních kostí jako modelových vzorků vyvinuta technika umožňující identifikovat až stovky proteinů díky jejich štěpení trypsinem přímo v kostních tkáních ("in-bone digestion") následovaného analýzou pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie s předřazenou kapalinovou chromatografií (LC-MS/MS). Tato technika byla následně aplikována na analýzu odoperovaných tkání lidských maxilárních a mandibulárních kostních tkání. Jak ve vzorcích maxilárních, tak mandibulárních kostí, bylo možné technikou přímého štěpení identifikovat značné množství proteinů. Navíc matematická analýza získaných dat umožnila též rozlišit mezi tkáněmi postiženými zánětem a zdravými tkáněmi. Přístup založený na přímém štěpení byl následně úspěšně rozšířen též na analýzu in vitro modelů lidských kostních tkání. Přímé štěpení...
|
|
|
Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Rudolf Andrýs Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce: VÝVOJ A APLIKACE AFINITNÍHO NOSIČE PRO IZOLACI LIDSKÝCH KARBONYL-REDUKUJÍCÍCH ENZYMŮ Již po několik tisíciletí tvoří základ lidské medicíny malé bioaktivní molekuly, které byly podávány ve formě rostlinných extraktů nebo syntetický připravených sloučenin. Jejich využití v moderní lékařské vědě ovšem není možné bez detailního porozumění jejich biochemických účinků a identifikace jejich molekulárních cílů. Metody chemické proteomiky, založené na specifické interakci mezi bioaktivní látkou a cílovou molekulou, patří v současné době k nejpoužívanějším technikám při identifikaci molekulárních cílů malých molekul. Oproti klasickým biochemickým metodám (např. 2D elektroforéza) se jedná o citlivé a především velmi selektivní techniky, díky kterým lze z komplexních biologických vzorků úspěšně identifikovat i biomolekuly, které se přirozeně vyskytují jen ve velmi malých koncentracích. Takovými biomolekulami jsou i karbonyl-redukující enzymy, které představují fyziologicky důležitou skupinu proteinů, jelikož se podílí na metabolismu řady endogenních (např. prostaglandiny, steroidní hormony) i xenobiotických (např....
|
|
|
Molecular mechanisms of Diamond-Blackfan anemia
Handrková, Helena ; Petrák, Jiří (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Trka, Jan (oponent)
Diamondova-Blackfanova anémie (DBA) je vzácný vrozený syndrom, jehož hlavními příznaky jsou normochromní makrocytická anémie a retikulocytopenie (selektivní de- ficience erythroidních prekurzorů). Přibližně polovina pacientů vykazuje další somat- ické anomálie a zpomalený růst. Terapie je symptomatická, ve většině případů jsou podávány kortikosteroidy. Na počátku této práce byly známy jen dva geny kauzální pro DBA, a sice geny kódující ribosomální proteiny (RP) S19 a S24, a jejich mutace byly nalezeny u čtvrtiny pacient s DBA. Cíli mého výzkumu bylo popsat důsledky těchto kauzálních mutací na úrovni buňky a najít další kauzální geny. Doposud byla u více než poloviny pacientů nalezena mutace v jednom z devíti genů kódujících ribosomální proteiny, včetně RPS17, RPL11 a RPL5, které jsou předmětem této disertační práce. Dále jsme studovali význam jedné vzácné sekvenční varianty ner- ibosomálního proteinu, který se účastní biogeneze ribosomů, protein arginin methyl- transferasy 3 (PRMT3). Varianta PRMT3 nalezená u jednoho z našich DBA pacientů nebyla plně funkční, ale její kauzální roli pro DBA jsme nepotvrdili. Naše poznatky přispěly k rozšíření spektra známých genů kauzálních pro DBA a podpořily hypotézu, že mechanismus patogeneze tohoto onemocnění spočívá v ribosomálním defektu. Klíčová slova...
|
|
|
Structural characterization of biotechnologically and medicinally important proteins.
Filandr, František ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Škultéty, Ľudovít (oponent)
Velké množství biologických procesů je závislé na strukturní dynamice proteinů a specifických protein-proteinových, nebo protein-ligandových interakcích závislých na specifických podmínkách uvnitř, či vně buněk. Analýza struktury proteinů klasickými metodami jako je rentgenová krystalografie, NMR, nebo nově cryo-EM poskytuje důležité struktury s atomárním rozlišením, avšak většinou ukazuje pouze statický obrázek bez detailů o dynamice, nebo transientních interakcích, a navíc často v nenativních podmínkách. Tyto detaily může doplnit strukturní hmotnostní spektrometrie, která umí poskytnout informace o proteinové dynamice, interakcích proteinů s jinými molekulami a také o specifických meziatomových vzdálenostech v samotných proteinech, nebo mez interakčními partnery, to vše při relativně nativních podmínkách. V této práci byla použita vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS), klasická proteomická analýza a turbidimetrie ke studiu biotechnologicky užitečných proteinů houbového celulolytického systému lytické polysacharidové monooxygenasy (LPMO) a celobiosadehydrogenasy (CDH) a rovněž fotosensitivní domény LOV2 pocházející z rostlinného fototropinu využitelné při fotodynamické terapii. Pomocí těchto metod byla sledována celulolytická reakce katalyzovaná redukovaným enzymem...
|
|
|
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Wallenfels, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru...
|
|
|
Studium metabolismu polyaminů v buněčném dělení a jejich úloha ve fyziologických pochodech rostlin
Gemperlová, Lenka ; Cvikrová, Milena (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Havel, Ladislav (oponent)
3.cÍLE Studium meÚabolismu po|yaminův pnůběhurůstovéhoa buněčného cyklu tabákové suspenzní ku|tury BY.2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2): určenípodilu biosynÚéry,degradacea konjugacena udrženíhomeostáze polyaminů. Dílčícíle: o Sledoviínízrrěn endogenníchhladin vo|ných a konjugovaných forempolyaminův průběhurůstovéhoa buněenéhocgtuLu.etove suspenzníkulturyBY-2. o Stanoveníaktivit biosyntetictcýchenzymůpolyaminů- ornithin-, arginin- a S-adenosylrnethionindekarboxylrázyv průběhurustového a buněčnéhocyklu tabákovésuspenzríkultury BÝ-2. o Stanovení aktiviý degradačního enzymu polyaminů ďaminoxidázy vprůběhurůstovéhoa buněčnéhocykiu tabrákové suspenztíkultury BY-2. Da|šícile: o Slďoviírrí zrrrěn endogenníchhladin volných a konjugovaných forem polyaminů u tabákové suspenzrí ku'ň'' BY.2 v podmínkáchabiotickéhostresu. . 9to9i.'- regulačních mechanismů homeostiíze polyaminů (tj.biosyntézy,degradacea konjugace)u rostlin tabákuiNícotiana tabacumL.) vprůběhudiumálníhocyklu. o Stanovenípodíluexkrecepolyaminůdo živnéhomédiau tabrákové suspenzníkultury BY-2 a u kultury vojtěšky(Medicago sativa) na udrženíhomeostázepolyarninů. o Sledoviíní zněn endogenních hladin polyarrrinů vpruběhu zygotickéa somatickéembryogenezesmrku-ztepilého(Picea abies L. (Karst.).
|
|
|
Study of conformations and conformational changes of proteins using mass spectrometric methods.
Kádek, Alan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Hnízda, Aleš (oponent)
Hmotnostně spektrometrické (MS) techniky si v průběhu posledních dvou desetiletí našly své trvalé místo mezi nástroji strukturní biologie. Kromě získání informace o primární sekvenci proteinů jsou stále častěji využívány i pro studium vyšší strukturní organizace bílkovin. Nedosahují sice atomárního prostorového rozlišení, jsou ale naopak prosty řady experimentálních omezení. MS strukturní techniky tak jsou schopny studovat molekuly za nativních podmínek v roztoku, jsou rychlé, mají nízkou spotřebu vzorku a jsou použitelné pro molekuly a jejich komplexy s velmi širokým rozsahem velikostí. Možná nejdůležitější je však jejich schopnost poskytnout informace o konformační dynamice proteinů, které tak mohou doplnit data získaná jinou strukturní technikou s vyšším prostorovým rozlišením v rámci integrativní strukturní biologie. V této disertační práci byla hlavní pozornost věnována technice vodík / deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS), která je jednou z nejvíc rozšířených strukturních MS metod. Rekombinantně připravená aspartátová proteasa nepenthesin-1 z láčkovek rodu Nepenthes byla charakterizována, imobilizována a podrobně testována s cílem rozšířit portfolio proteas dostupných pro HXMS experimenty a zvýšit prostorové rozlišení této techniky. Po úspěšné implementaci do HXMS...
|
|
|
Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Rudolf Andrýs Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce: VÝVOJ A APLIKACE AFINITNÍHO NOSIČE PRO IZOLACI LIDSKÝCH KARBONYL-REDUKUJÍCÍCH ENZYMŮ Již po několik tisíciletí tvoří základ lidské medicíny malé bioaktivní molekuly, které byly podávány ve formě rostlinných extraktů nebo syntetický připravených sloučenin. Jejich využití v moderní lékařské vědě ovšem není možné bez detailního porozumění jejich biochemických účinků a identifikace jejich molekulárních cílů. Metody chemické proteomiky, založené na specifické interakci mezi bioaktivní látkou a cílovou molekulou, patří v současné době k nejpoužívanějším technikám při identifikaci molekulárních cílů malých molekul. Oproti klasickým biochemickým metodám (např. 2D elektroforéza) se jedná o citlivé a především velmi selektivní techniky, díky kterým lze z komplexních biologických vzorků úspěšně identifikovat i biomolekuly, které se přirozeně vyskytují jen ve velmi malých koncentracích. Takovými biomolekulami jsou i karbonyl-redukující enzymy, které představují fyziologicky důležitou skupinu proteinů, jelikož se podílí na metabolismu řady endogenních (např. prostaglandiny, steroidní hormony) i xenobiotických (např....
|
|
|
Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Petrák, Jiří (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
ABSTRAKT Systém oxygenas se smíšenou funkcí se v organismu podílí na biosyntéze endogenních a také metabolismu exogenních látek (např. léčiv nebo chemických prokarcinogenů). Substráty jsou biotransformovány terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450 (P450). Katalytické vlastnosti některých jejich zástupců (např. studované izoformy 2B4) jsou pozměněny v přítomnosti redoxního partnera - cytochromu b5 (cyb5). Oba cytochromy jsou ukotveny hydrofobními doménami v lipidické membráně endoplasmatického retikula, zatímco jejich katalytické domény jsou exponovány do cytosolu buňky. K rozšíření současných znalostí o struktuře a interakcích studovaných cytochromů byly využity dva přístupy založené na kovalentním síťování aminokyselin v "nulové vzdálenosti" (angl. "zero-length cross-linking"): (1) chemické síťování činidlem 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) propojujícím ve vodném prostředí přístupné karboxylové skupiny s primárními aminy, a (2) síťování pomocí foto-labilního analogu methioninu (pMet), který se po aktivaci UV zářením může vázat na libovolnou aminokyselinu, a to v hydrofobním i hydrofilním prostředí. pMet byl do sekvence cyb5 inkorporován namísto methioninu během rekombinantní exprese proteinu v E. coli, která probíhala v limitním médiu obohaceném o aminokyselinový...
|
|
|
Lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Štambergová, Hana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Wimmerová, Michaela (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Hana ŠTAMBERGOVÁ Školitel prof. Ing. Vladimír WSÓL, Ph.D. Název disertační práce Lidské membránově vázané karbonylreduktasy Lidské membránově vázané enzymy podílející se na metabolismu karbonylových sloučenin představují velice zajímavou skupinu, ve které navzdory velkému úsilí vědců zůstává řada doposud necharakterizovaných enzymů a to především z velké nadrodiny dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR). V lidském genomu je v současné době identifikováno 75 SDR zástupců, přičemž pouze 20 % z nich je považováno za dobře charakterizované. Na druhou stranu 30 % těchto proteinů zůstává zcela nepopsaných. SDR enzymy se podílí na metabolismu steroidů, sacharidů, retinoidů či prostaglandinů a hrají tak důležitou roli v řadě fyziologických dějů a závažných onemocnění (např. hormon-dependentní nádory, metabolický syndrom, diabetes mellitus). Mimoto jsou zapojeny do biotransformace některých exogenních sloučenin. Bylo identifikováno několik SDR enzymů hrajících významnou roli v I. fázi biotransformace xenobiotik (např. u doxorubicinu, dolasetronu, benfluronu, metyraponu, ketoprofenu), ale doposud pouze jediný membránově vázaný zástupce, 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1)....
|
host ::
RSS.