|
|
Structure-assisted design of inhibitors targeting medicinally relevant enzymes
Djukic, Stefan ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Kutá-Smatanová, Ivana (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Racionální návrh léčiv je moderní efektivní přístup, využívající detailní znalosti trojrozměrné struktury k návrhu a optimalizaci nových inhibitorů cílících na klinicky relevantní enzymy. Metodou strukturní biologie, hojně využívanou v racionálním návrhu léčiv, je rentgenová krystalografie. Její silnou stránkou je schopnost poskytnout detailní obraz komplexu protein-inhibitor s rozlišením umožňujícím analýzu jednotlivých interakcí mezi inhibitorem a proteinem.PNP hraje klíčovou roli v metabolické dráze záchrany purinových nukleotidů, a je tak zajímavým terapeutickým cílem nejen pro léčbu T buněčných hematologických malignit, ale i parazitických infekcí. V našich studiích jsme se zaměřili na lidskou PNP a její ortholog v M. tuberculosis s cílem vyvinout nové inhibitory s vysokou specificitou a selektivitou pro každý z enzymů. Prezentované inhibitory patří do skupiny acyklických nukleosid fosfátů s 9-deazahypoxanthinovou nukleobází, obsahující tři funkční skupiny, které se vážou na všechna tři důležitá rozhraní aktivního místa: purin, fenyl a fosfonátovou skupinu. Nejlepší z inhibitorů dosáhly hodnot IC50 až 19 nM a 4 nM pro lidskou, respektive mykobakteriální PNP. Zavedení malých substituentů, jako například methoxy- nebo bromo- skupiny, na centrální fenylový kruh vedlo ke snížení afinity inhibitoru...
|
|
|
Mechanistic and structural studies of the cGAS-STING signalling pathway
Vavřina, Zdeněk ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Signální dráha synthasy cyklického GMP-AMP (cGAS) a Stimulátoru genů pro interferony (STING) má zásadní roli ve vrozeném imunitním systému. Dráha je aktivována dvouvláknovou DNA (dsDNA) z patogenních organismů nebo cyklickými dinukleotidy, které slouží jako druzí poslové bakterií. Aktivace dráhy spouští expresi interferonů I. typu a prozánětlivých cytokinů. Disertační práce zkoumá vztah mezi cGAS a jeho substráty, resp. proteinem STING a jeho agonisty, z mechanistického a strukturního hlediska. Enzym cGAS je živočišný vnitrobuněčný senzor dsDNA, jež po navázání DNA syntetizuje cyklický dinukleotid 2′,3′-cGAMP aktivující adaptorový protein STING. Kromě 2′,3′-cGAMP může být STING aktivován také 3′,3′-cyklickými dinukleotidy, které slouží jako druzí poslové v bakteriích. Zkoumali jsme různé dinukleotidcyklasy, abychom lépe porozuměli jejich substrátové specifitě a mohli je využít pro přípravu nových cyklických dinukleotidů aktivujících STING. Jako nejvhodnější pro přípravu 2′,3′-cyklických dinukleotidů jsme identifikovali myší cGAS. Dále jsme identifikovali enzymy DncV z Vibrio cholerae a DisA z Bacillus thuringiensis jako vhodné pro syntézu 3',3'-cyklických dinukleotidů. Tyto enzymy se vyznačují vysokou katalytickou aktivitou, schopností využívat modifikované nukleosid-5'-trifosfáty jako substrát a...
|
|
|
Příprava a charakterizace lidských buněčných kofaktorů retrovirové integrace
Čermáková, Kateřina ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
LEDGF/p75 je lidský buněčný vazebný partner integrasy viru HIV-1. Jak prokázaly nedávné studie, LEDGF/p75 hraje zásadní roli v replikačním cyklu tohoto viru. Jeho funkce v procesu retrovirové integrace je velice dobře prostudována. Byla identifikována doména zodpovědná za interakci s virovou integrasou (IBD) a byly provedeny strukturní studie, které poskytly detailní informace o této interakci. Ostatní jeho úlohy však zatím příliš charakterizovány nejsou. Je jisté, že jako transkripční faktor zasahuje nejen do replikace viru HIV-1, ale také do procesů spojených s buněčným stresem, autoimunity a rozvoje některých druhů rakoviny. Dodnes bylo odhaleno několik přirozených vazebných partnerů LEDGF/p75, jejichž vazba na tento protein je zprostředkovávána stejnou doménou jako vazba intergasy viru HIV- 1; jedním z nich je i protein PogZ. Bylo prokázáno, že vzájemná interakce LEDGF/p75 a PogZ je u obou těchto proteinů zajištěna jejich C-koncovými úseky. Abychom získali informace o této interakci a o topologii vazebných míst LEDGF/p75 a PogZ, rozhodli jsme se provést strukturní studii jejich vazebných domén. Tato strukturní studie je zásadní pro pochopení přirozené buněčné funkce LEDGF/p75 a může pomoci ve vývoji inhibitoru specificky blokujícího interakci LEDGF/p75 a virové integrasy, aniž by došlo k narušení...
|
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
|
|
Studium exprese serinracemasy v CNS pacientů postižených epilepsií
Vorlová, Barbora ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Serinracemasa je enzym, který za pomoci kofaktoru pyridoxal-5'-fosfátu přeměňuje L-serin na D-serin. D-serin se podílí na aktivaci N-methyl-D-aspartátových receptorů pro glutamát - klíčových receptorů zajišťujících přenos nervového vzruchu v savčím mozku. Dysfunkce zmíněných receptorů může vést k různým neuropatologiím, jako je schizofrenie, mozková ischemie, neurodegenerativní onemocnění či epilepsie. Serinracemasa se proto stává slibným farmaceutickým cílem pro léčení těchto chorob. V této práci byly charakterizovány tři monoklonální protilátky proti lidské serinracemase a nejlepší z nich byla využita pro detekci tohoto enzymu v resekovaných vzorcích lidských epileptických tkáních metodou Western blot. Pro správnou interpretaci výsledků byla následně ověřena přesnost zpracování a analýzy jednotlivých vzorků. Nakonec byla měřena aktivita lidské serinracemasy pomocí L-serin-O-sulfátu, substrátu s doposud nejvyšší známou afinitou.
|
|
|
Studium struktury transkripčních faktorů regulujících metabolismus pankreatických beta buněk
Duchoslav, Vojtěch ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Nkx6.1 je homeodoménový protein o velikosti 37,8 kDa a důležitý transkripční faktor regulující transkripci významných genů beta pankreatických buněk. Nedostatečná exprese tohoto proteinu vede k porušené transkripci glukozového přenašeče Glut2, jejímž důsledkem je snížené vychytávání glukózy z krve a narušení celého metabolismu glukózy. Dále je potlačena proliferace beta pankreatických buněk kvůli nízké transkripci mitogenu cyclin D2 spouštějícího mitotické dělení buněk. V neposlední řadě se vážně naruší biosyntéza inzulinu špatnou transkripcí genů pro proteiny Ero1lb a Slc30a8, což vede k poklesu jeho produkce. Nkx6.1 hraje roli v patogenezi cukrovky druhého typu. Při tomto onemocnění vykazují beta buňky zmenšenou schopnost kompenzovat zvýšený požadavek na produkci inzulinu. Důvodem je nízká sekrece inzulinu a smrt beta pankreatických buněk. Jedna z možných příčin muže být špatná regulace transkripce genů, účastnících se zmíněných procesů. Nkx6.1 rozeznává vysoce konzervovanou oligonukleotidovou sekvenci DNA (TTAATTAC). Vazba k DNA je navíc regulována doménou se zvýšeným výskytem kyselých aminokyselinových zbytků na karboxylovém konci molekuly. V rámci bakalářské práce byly přiřazeny rezonance atomů hlavního řetězce proteinu Nkx6.1 pomocí metody nukleární magnetické rezonance (NMR). K tomuto účelu...
|
|
| |
|
|
Charakterizace rekombinantního fragmentu protilátky proti znaku CD3
Písačková, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Monoklonální protilátka MEM-57 rozpoznává antigen CD3, exprimovaný na T-lymfocytech periferní krve. Komplex membránových glykoproteinů CD3 asociuje s receptorem T-buněk a je zodpovědný za přenos aktivačního signálu. Protilátka MEM-57 má proto výrazný diagnostický a terapeutický potenciál. Mohla by být využita v diagnostice autoimunitních onemocnění, při klasifikaci T-buněčných leukemií nebo jako imunosupresivum při transplantacích. Nejslibnějším terapeutickým využitím protilátky MEM-57 by však byla konstrukce protilátkového fragmentu ve formátu BiTE (z angl. bispecific T-cell engager) pro léčbu rakoviny. Při konstrukci tohoto protilátkového formátu by byl jednořetězcový variabilní fragment protilátky MEM-57 (scFv, z angl. single-chain fragment, variable) spojen v jedné molekule s fragmentem scFv protilátky proti nádorovému antigenu. Tato práce je zaměřena na charakterizaci rekombinantního fragmentu scFv protilátky MEM-57. K heterologní expresi byl použit kmen E. coli BL21 (DE3) a vektor pET22b(+) kódující sekvenci pelB pro akumulaci produktu v periplasmatickém prostoru, vlastní rekombinantní protilátkový fragment scFv MEM-57, epitop c-myc a histidinovou kotvu. Byl vypracován dvoukrokový purifikační protokol zahrnující chelatační a ionexovou chromatografii, který poskytuje dostatečné množství...
|
|
| |
|
|
Příprava a krystalizace metabolického represoru LutR z bakterie Bacillus subtilis
Soldánová, Anna ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Kutá-Smatanová, Ivana (oponent)
Metabolické transkripční represory jsou proteiny, které regulují transkripci různých genů bakteriálního metabolismu. Typicky obsahují dvě domény: N-koncovou doménu vázající DNA (DBD, z angl. DNA-binding domain) a C-koncovou doménu vázající molekulu efektoru. Po vazbě efektoru (nejčastěji molekuly metabolitu) protein změní svou konformaci, čímž dojde ke změně jeho afinity k DNA operátoru a následné modulaci transkripce genů kódujících proteiny dané metabolické dráhy. LutR patří do rodiny bakteriálních transkripčních regulátorů GntR. V divokém kmeni Bacillus subtilis RO-NN-1 je LutR zodpovědný za represi transkripce genů potřebných pro využití laktátu, zatímco funkce LutR z laboratorních kmenů B. subtilis PY79 a 168 se liší. Díky mutaci je produkovaný protein o prvních 21 aminokyselin kratší, což výrazně ovlivňuje jeho vazebnou specificitu při rozpoznávání sekvence DNA. Tato varianta LutR pak funguje jako globální regulátor a reguluje velký počet genů, jejichž transkripce je spjata s přechodem z fáze exponenciálního růstu bakteriální populace do fáze stacionární. Znalost 3D struktury komplexu LutR s DNA by pomohla objasnit přesný mechanismus, jakým delece v DBD LutR mění její vazebnou specificitu. V rámci této práce byla heterologní expresí v Escherichia coli připravena DBD LutR z divokých kmenů B....
|
host ::
RSS.