Original title: Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Translated title: P53 protein isoforms production and purification in the bacterial expression system
Authors: Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (referee) ; Brázda, Václav (advisor)
Document type: Master’s theses
Year: 2018
Language: cze
Publisher: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract: [cze] [eng]
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti. Apart from the p53 protein, the TP53 tumor-suppressor gene is expressed as another eleven protein isoforms with the use of alternative splicing, alternative promotors and alternative translational initiation sites. Abnormal expression of these isoforms has been observed in tumor tissues. The binding properties as well as the biological functions are also modulated, due to sequential and therefore structural differences from the p53 protein. p53 is regulated by these isoforms in both suppressive and supportive manner. Explanation of the p53 isoform regulation mechanism in cells could lead to desired alternative splicing of the chosen isoforms, and modulation of isoform expression could be used in cancer treatment based on p53 therapy. Basic information about p53 protein is summarised in the theoretical part of this master thesis, supplemented with recent advances in the field of p53 isoforms, as well as the Gateway cloning method. The main goal of the experimental part was p53 isoform production in a bacterial expression system. Prior to the protein production, DNA sequences coding twelve p53 isoforms were prepared using PCR and Gateway cloning. In total, twelve entry clones and eight expression clones were prepared by cloning the isoforms’ sequences. After the protein production and purification, the detection using SDS-PAGE and Western Blotting was performed with five p53 protein isoforms: p53, 40p53, 40p53 and 40p53. DNA binding properties of p53 protein isoforms will be tested in subsequent research.
Keywords: cancer; gateway cloning system; isoforms; p53 protein; gateway klonování; izoformy; protein p53; rakovina

Institution: Brno University of Technology (web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library.
Original record: http://hdl.handle.net/11012/80642

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-376812


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Brno University of Technology
Academic theses (ETDs) > Master’s theses